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ELISA實驗操作要點:降低ELISA背景的四點tips
  • 發(fā)布日期:2023-10-16      瀏覽次數(shù):582
    • 在ELISA試劑盒操作中,我們都認(rèn)為ELISA實驗的原理似乎很簡單,不外乎固定抗原,添加一抗、二抗和底物,間中夾雜著洗滌和封閉。然而,即使是平淡無奇的洗滌和封閉,如果做得不太好,也有可能毀了整個實驗。在實驗結(jié)束時,我們是否能獲得有意義的信息,這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會影響您對結(jié)果的判斷。如何降低ELISA的背景,下面有一些tips。
      一、洗滌很重要

      洗滌步驟看似很無聊,其實很重要,因為如果未結(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中,那么它會增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過高,而您懷疑洗滌不夠時,可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

      二、封閉更關(guān)鍵
      封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當(dāng)延長封閉時間。

      如果您一直被背景問題所困擾,那么也許您該花些時間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時間,但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。

      非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時起作用,因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),它會降低特異結(jié)合,產(chǎn)生假陰性。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。

      蛋白封閉液則有所不同。它們與開放位點結(jié)合并封閉,同時穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過,它的缺點在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。

      三、抗體濃度須優(yōu)化
      我們通常會follow師兄師姐留下來的操作步驟,但是如果試劑稍有不同,則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,非特異的抗體結(jié)合會增加背景。為了防止這一點,切勿使用過多的一抗或二抗。

      四、檢測試劑要適量
      另一點也很顯而易見:切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高,或者未正確稀釋,則會導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度,如有必要,優(yōu)化一下何時應(yīng)加入終止液。

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