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（ELISA測(cè)定操作規(guī)程（以小鼠TNF-a為例）

一、原理與意義

通過抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的TNF-a與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin）與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺（OPD）,出現(xiàn)黃色,加終止液濃硫酸,顏色變深,在492nm處測(cè)OD值,TNF-a濃度與OD值成正比,可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TNF-a濃度。它是樣品中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的定性和定量方法。

二、試劑盒的組成

96/48微孔板（1塊,已包被抗小鼠TNF-a單抗）、樣品稀釋液（1瓶）、*抗體工作液（1瓶）、酶標(biāo)抗體工作液（1瓶）、底物稀釋液（1瓶）、終止液（1瓶）、洗滌液（20×,1瓶）、標(biāo)準(zhǔn)品（2000 pg/ml,2管,凍干粉）、OPD片（3片）、坐標(biāo)紙（1張）。

三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

1、試劑配制:洗滌液按1:20三蒸水稀釋;標(biāo)準(zhǔn)品在用前每管加入200 ?l蒸餾水溶解即可（具體見說明書）;底物工作液應(yīng)在顯色前5-10 min將OPD片放入底物稀釋液中溶解,每片加5 ml液。

2、標(biāo)本收集:采集血清或體液盡早檢測(cè),2~8 ℃保存一天需更長時(shí)間須冷凍（-20℃）保存,避免反復(fù)凍融;組織（胎肝、胎腦等）實(shí)驗(yàn)前一天組織勻漿,用90%體積RIPA裂解液（PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA）和10%體積的10 mM PMSF進(jìn)行組織勻漿（10%）,冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。

3、器材準(zhǔn)備:酶標(biāo)儀、37 ℃恒溫烤箱、濾紙、托盤、量筒、燒杯、各種規(guī)格的移液器、離心管、管架和廢液缸等。三蒸水自備。

四、操作步驟

1、設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔8孔（根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6孔）,每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,*孔再加標(biāo)準(zhǔn)品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔,zui后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul。第8孔為空白對(duì)照。

2、加樣:待測(cè)樣品孔中每孔各加入待測(cè)樣品100ul。

3、將反應(yīng)板置于37 ℃×120 min。

4、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次,向?yàn)V紙上扣干。

5、每孔中加入*抗體工作液50ul。

6、將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃×60 min。

7、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。

8、每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。

9、將反應(yīng)板置于37 ℃ 120 min。

10、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。

11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗處反應(yīng)5~10 min。

12、每孔中加入50ul終止液混勻。

13、用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)吸光值。

五、計(jì)算結(jié)果與判斷

1、以標(biāo)準(zhǔn)品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、所有OD值都應(yīng)減去空白管值后再計(jì)算。

根據(jù)樣品OD值在該標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出相應(yīng)樣品中TNF-a含量。

六、注意事項(xiàng)

1、以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待查樣品均建議做復(fù)孔,每次測(cè)定均要做標(biāo)準(zhǔn)孔。

2、本試劑盒宜置-20 ℃冷藏保存。

3、本試劑盒取出的試劑在室溫（20~25 ℃）環(huán)境下使用,溶液應(yīng)輕輕搖勻后使用。

4、本試劑盒含2M硫酸,不要將它與含*的廢物混在一起。

5、板條開封后剩余板條要再封好,保持板條干燥。

6、避免交叉污染。如洗滌時(shí)向樣品待測(cè)蛋白含量可能高的一側(cè)傾倒。

7、提前24 h打開烤箱預(yù)熱。

8、底物工作液應(yīng)在顯色前5~10 min配制。若配制時(shí)間過長,會(huì)變質(zhì)。

9、甩盡孔內(nèi)液體,每孔加350 ul左右洗滌液,靜止30 s后甩盡。尤其加抗體工作液或底物時(shí)盡量弄干孔內(nèi)液體。且孵育過程中要蓋住各反應(yīng)孔,防止液體恢復(fù)。

10、盡量防止樣品待測(cè)蛋白濃度過高而出現(xiàn)酶標(biāo)儀顯示out。當(dāng)酶標(biāo)儀測(cè)定值出現(xiàn)許多out時(shí),可通過稀釋一定倍數(shù)后用可見光分光計(jì)測(cè)定,所有孔均同時(shí)測(cè)定。