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冰凍切片原理及方法介紹
  • 發(fā)布日期:2023-01-03      瀏覽次數(shù):1155
    • 實(shí)驗(yàn)方法原理:冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片。它實(shí)際上是以水為包埋劑,將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程,大大縮短了制片時(shí)間。同時(shí),由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水、透明和浸蠟等步驟,因而較適合于脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片,并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷。

      實(shí)驗(yàn)材料:新鮮組織

      試劑、試劑盒:H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性樹(shù)膠

      儀器、耗材:OCT速凍架恒冷箱切片機(jī)烘箱熒光顯微鏡

      實(shí)驗(yàn)步驟

      一取材

      應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料,防止組織發(fā)生死后變化。

      二速凍

      1、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)。

      2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)。

      3、當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v,此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。

      4、在制成凍塊后,即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。

      5、若需要保存,應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/span>

      三固定

      1、樣品托上涂一層OCT包埋膠,將速凍組織置于其上,4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

      2、取下組織置于錫箔或者玻片上,樣品托速凍。

      3、組織置于樣品托上,其上再添一層OCT膠,以wanquan覆蓋為宜,速凍架(PE)上30min。

      四切片

      1、恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī),其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi),故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響,可連續(xù)切薄片至5-10μm。

      2、切片時(shí),低溫室內(nèi)溫度以-15℃ ~ -20℃為宜,溫度過(guò)低組織易破碎,抗卷板的位置及角度要適當(dāng),載玻片附貼組織切片,切勿上下移動(dòng)。

      3、切好室溫放置30min后,入4℃丙酮固定5-10min,烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。

      4、進(jìn)行抗原熱修復(fù),微波熱修復(fù)也可,室溫自然冷卻??捎?%H2O2孵育5-10min,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。

      五免疫熒光染色

      1、冰凍切片室溫晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(shí)(此步可不洗)。

      2、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定,原則是可以均勻覆蓋組織面,且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸)。

      3、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒,室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

      4、第二天先將濕盒放到37℃回溫1h,然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收,將切片插入到小染缸PBS沖洗。

      5、滴加用PBS稀釋好的二抗(避光)置于分子雜交箱中37℃孵育1小時(shí)?;厥斩?,切片置于染缸內(nèi),PBS洗5min×3次。

      6、滴加DAPI工作液染核,室溫10-20min(工作濃度0.1%染色15min)。

      7、回收DAPI,滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠,用處理干凈的蓋玻片封片,即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

      8、做好的切片放在切片盒內(nèi),置于4℃冰箱,可保存一周左右。


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